論述PCR反應條件的控制
點擊次數(shù):913 更新時間:2022-06-28
PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時間的設置:基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。PCR反應條件的控制如下:
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
5. 引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。
6. 反應溫度
(1)變性溫度和時間95℃,30 s。
(2)退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
(3)延伸溫度和時間72℃,1 min/kb(10 kb內(nèi))。
(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)。
7. 循環(huán)次數(shù)
一般為25 ~30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,循環(huán)數(shù)超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,出現(xiàn)了所謂的“平臺期"。