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介紹選擇流式抗體技巧
點擊次數(shù):839 更新時間:2022-08-22

     流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件:目標蛋白特異性,反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實驗。流式抗體能夠在短時間內(nèi)檢測分析或分選大量細胞,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。其純度、批次穩(wěn)定性、特異性,以及流式結(jié)果的可重復(fù)性備受重視。

流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中,盡量減少實驗工序和過程,以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。

      隨著流式細胞術(shù)的日益發(fā)展,流式抗體及熒光標記產(chǎn)品的種類、數(shù)量也在不斷增多,加上多色分析實驗方案需求的增長,逐漸產(chǎn)生了抗體難選擇、熒光難搭配等問題,如何選擇合適的流式抗體,也成為了流式技術(shù)是否能成功的關(guān)鍵因素之一。下面介紹選擇流式抗體技巧:

一、滿足抗體具備的基本條件

確定所需檢測的指標,目的細胞的特異性表面標記或胞內(nèi)標記;

根據(jù)檢測樣本的種屬選擇抗體,流式抗體基本無法進行種屬交叉反應(yīng);

根據(jù)抗體的說明,明確是否可以用于流式實驗。

二、確定所使用儀器的參數(shù)配置

激光器:不同的流式細胞儀激光器不同,常見的有405nm,488nm和635nm,需要根據(jù)具體的儀器進行確定。

濾光片:檢測通道的多少,決定最多可以同時檢測幾個指標。熒光素的發(fā)射波長與濾光片有關(guān),所選擇熒光素要在儀器的可檢測范圍內(nèi)。

儀器:相同的熒光在不同的儀器上檢測通道可能不同,需要參照儀器的說明。

三、熒光的選擇

熒光有強弱之分,如抗原表達弱或分群不明顯的建議選擇強熒光,如PE、APC;反之,抗原表達強或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC即可。常用熒光強弱排序程度為:PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

四、多色熒光搭配

很多實驗需要同時檢測幾個指標,此時就需要多個熒光標記進行搭配。流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的:流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、的抗體有多少種熒光標記。

能檢測多少通道是又激光決定的需要注意所使用的儀器有哪些激光。每個檢測通道只能選擇1種熒光素,各通道之間的熒光素可以隨意搭配,檢測通道不能沖突。

如果需要做多個指標,而流式細胞儀能檢測的通道不夠,首先將指標歸成2類,再將樣本分成2份,分別進行檢測。

所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少,否則將會導(dǎo)致較大的補償。例如,PE-Ccy5與APC同時標記,將會導(dǎo)致補償過度,需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。
五、同型對照抗體

同型對照,是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色,類似于陰性對照,是流式細胞實驗*的一項。

同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標記的免疫球蛋白,也要求使用相同劑量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1),同型對照則為Mouse IgG1-FITC.

如果是純化的一抗加熒光標記的二抗,那么應(yīng)該選擇與一抗相對應(yīng)的同型對照抗體,如純化的CD3+PE標記的二抗,則對照為純化的同型對照+ PE標記的二抗。

有時候同型對照的表達會比抗體的表達高,首先檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次,因為有些標志在細胞的表面或者胞內(nèi)表達不高,而跟其類似的抗原非常多,那么同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性,所以會造成這種現(xiàn)象。這個時候推薦使用其他陰性對照,如空白對照等。



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