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ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。
ELISA的檢測目的是為了實驗提供準(zhǔn)確的實驗依據(jù),為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性,在實驗過程中必須堅持全面的質(zhì)量控制和全過程質(zhì)量控制,在收集標(biāo)本前都必須有一個完整的計劃。
ELISA標(biāo)本的處理:
1、血清:室溫血液私人凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
2.血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,如有沉淀形成,應(yīng)再次離心
3.尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成分時,用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)仔細(xì)收集上清,檢測細(xì)胞內(nèi)的成分時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成分。
5.組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量,加入一定量的PBS,PH7.4,用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?,?biāo)本融化后任然保持2-8°C的溫度,加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,分裝后一份待檢測,其余冷凍備用,
6.標(biāo)本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行試驗,若不能馬上進行試驗,可將標(biāo)本放于-20°C保存,單應(yīng)避免反復(fù)凍融。
在檢測時,受檢標(biāo)本(測定其中的抗原)與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體,通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。
注意事項:
1、每個樣本量收集體積=100ulx檢測種類,如果要做復(fù)孔,標(biāo)本量收集體積=100ulx檢測種類x2
2、樣本收集后若在一周內(nèi)進行檢測可保存于2-8°C,若不及時檢測,請進行分裝,凍存于-20°或-80°C,避免反復(fù)凍融
3、試劑盒的檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍,建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本。
4、血清標(biāo)本采集是應(yīng)注意避免溶血,紅細(xì)胞溶解是會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色
5、為了保證尿液檢測的準(zhǔn)確性,必須正確收集尿液標(biāo)本和保存,收集尿液的容器必須要清潔干燥,最好使用一次性的容器,避免因用藥并清潔不到而造成的污染,尿液樣本必須新鮮,留取后,應(yīng)及時檢測或保存
6、標(biāo)本宜在新鮮是檢測如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久,其中可能發(fā)生聚合,間接法ELISA中樂視本底加深,
7、反復(fù)凍融會使蛋白效價降低,所以待測樣本如需多次檢測,宜少量分裝凍存。