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抗體是哺乳動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對抗病原體的核心,它是在病原體刺激下由漿細胞(效應(yīng)B細胞)所分泌的一種免疫球蛋白,能夠識別并結(jié)合特異的病原體抗原,隨后通過介導(dǎo)中和作用、調(diào)理作用、效應(yīng)T細胞殺傷等來清除病原體
特異性(specificity)的本質(zhì)含義是“Connected with one particular thing only"即只與唯yi的特定事物相關(guān),具有專一性。在免疫學(xué)上我們會說“抗體具有特異性",指的就是抗體具有專一性,某一特定的抗體只能與唯yi 一種抗原結(jié)合。其實準確來講是一類具有特定抗原表位的抗原,因為某些不同的抗原具有相同的抗原表位(稱為交叉抗原),也可與同一種抗體特異性結(jié)合??蒲泄ぷ麟x不開抗體,WB、IP、IHC、IF、ChIP和FC都需要用到抗體,這幾種實驗方法中的抗體特異性選擇需要考慮的要點了解下,特異性的選擇主要需要考慮四個方面:蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標(biāo)記物的特異性。
1.蛋白特異性
針對需要檢測的蛋白查找抗體,幾個細節(jié)要區(qū)分:
a.重組蛋白如果不是全長表達,則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
b.內(nèi)源性蛋白好能清楚其剪切與修飾的方式,特殊表型的蛋白需要進行序列比對,并結(jié)合抗體免疫原序列,查看交叉反應(yīng)的情況。
c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點,不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在,不宜一概而論。
2.種屬特異性
同種蛋白不同物種,有著或大或小的差異。
a. 目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計多肽抗原的,根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。
b. 一些稀有種屬很難找到抗體,可以通過蛋白的序列比對,選擇同源序列免疫的抗體,不過一般這種情況商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴,如果可以申請到免費的抗體樣品,則利于抗體選擇。
3.實驗方法特異性
目前使用抗體的實驗方法有很多,不同的使用方法過程中,因為對蛋白樣品的處理方式不一樣,蛋白的含量有差異,對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。
4.標(biāo)記物的特異性
一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標(biāo)記的一抗,比如 WB、IHC 等,都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗,可能就會使用到直接標(biāo)記的一抗,比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實驗中,需要選配不同的熒光標(biāo)記物。