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Tth MutS Protein公司正在出售的產(chǎn)品:小鼠成纖維細(xì)胞系 RH血型C糖蛋白封閉多肽 腦胞內(nèi)原蟲(chóng)屬通用·PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠細(xì)胞間粘附分子2(ICAM-2/CD102)試劑盒 ELISA 土壤速效氮活性比色法檢測(cè)試劑盒(擴(kuò)散法) 瑞士乳桿菌 磷化細(xì)胞內(nèi)流鉀通道蛋白Kir5.1抗體
更新時(shí)間:2024-01-14
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
Tth MutS Protein | 50 ug | A-PJ1149 |
描述:
DNA 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)主要由三種蛋白組成,包括 MutS、MutL 和 MutH。其中 MutS 負(fù)責(zé)識(shí)別錯(cuò)配或未結(jié)合位點(diǎn)并與之結(jié)合,隨后 MutL 蛋白與 MutS-DNA 形成復(fù)合體,增強(qiáng)其穩(wěn)定性,并激活 MutH 的內(nèi)切酶活性,協(xié)同解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白將錯(cuò)配序列切除。 ttMutS 蛋白是一種分離自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白,在最適溫度 65-75℃ 范圍內(nèi),該蛋白具有依賴于 DNA 的 ATPase 活性。 Tth MutS 蛋白在DNA 復(fù)制中識(shí)別錯(cuò)配堿基和插入堿基形成的 Loop 結(jié)構(gòu),其緊密結(jié)合 Loop 結(jié)構(gòu)從而阻止聚合酶的延伸。因此,其可用于錯(cuò)配 PCR 反應(yīng)(ARMS-PCR)和基因芯片中,除此外,在基因合成中能阻止錯(cuò)配的產(chǎn)生,降低基因突變率。
Storage Buffer:
20mM Tris-HCl,pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
50%甘油
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開(kāi),引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。
2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?
沒(méi)有ct值
檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。
ct值過(guò)晚
在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
極細(xì)密螺旋體染料法熒光定量PCR試劑盒 | α1抗胰蛋白ELISA試劑盒 α1-AT免費(fèi)代測(cè)試劑 | 人腺病毒D69型探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
腦胞內(nèi)原蟲(chóng)屬通用PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng) | 抵抗樣分子βELISA試劑盒 RELM-β免費(fèi)代測(cè)試劑 | 諾如病毒4型PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格 |
轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE核檢測(cè)試劑盒 | 細(xì)胞毒相關(guān)蛋白AELISA試劑盒 | 瘰疬分枝桿菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
梅迪一維斯納病毒PCR檢測(cè)試劑盒 | 凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激IELISA試劑盒 | 駱駝痘病毒探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
米曲霉通用型染料法熒光定量PCR試劑盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移8ELISA試劑盒 | 雞減蛋綜合征病毒RT-1976探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
諾如病毒G4型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 二氫二醇脫氫2ELISA試劑盒 | 產(chǎn)腸毒性大腸桿菌(ETEC)核檢測(cè)試劑盒 |
駑巴貝斯蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | 泛蛋白連接E3成分N-識(shí)別蛋白4ELISA試劑盒 | 禽腎炎病毒2型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
米黑根毛霉探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | 防御α3ELISA試劑盒 | 款冬花染料法PCR鑒定試劑盒 |
美洲四棱線蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | 非甲基化寡核苷ELISA試劑盒 | 普雷沃菌屬通用PCR檢測(cè)試劑盒直銷 |
牛血吸蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | 封閉蛋白24ELISA試劑盒 | 羅布羅布芽生菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
輪狀病毒A群探針?lè)晒舛?/span>RT-PCR試劑盒 | 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10(FGF10)檢測(cè)試劑盒elisa | 病毒N2亞型(AIV-N2)PCR檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法) |
腦膜炎奈瑟菌群PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū) | 人胎盤蛋白(PP)試劑盒ELISA | 漢坦病2型探針?lè)晒舛?/span>RT-PCR試劑盒 |
馬皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒 | 人白介17A(IL-17A)ELISA試劑盒 | 雞傷探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
犬血支原體探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 | 人艾柯病毒IgM(ECHO IgM)ELISA試劑盒 | Tth MutS Protein胰闊圓盤吸蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 |
豬圓環(huán)病毒/偽狂犬病毒(PCV/PRV)核檢測(cè)試劑盒 | 人轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白4(SLC44A4)ELISA試劑盒 | 禽腎炎病毒型PCR檢測(cè)試劑盒 |