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 RAPA HiFi DNA 聚合酶，其來源于高保真 DNA 聚合 酶，并加入了增強的延伸結構，使其具有超保真性能（~280 倍 Taq）、長片段擴增能力、高產量。長片段擴增能力，使用 該酶可輕松擴增 8kb 的基因組 DNA、20kb 的λDNA、8kb 的 cDNA。該酶具有 6kb/min 以上的延伸速度。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、強 3’-5’的外切酶活性，產物為平末 端。

特點和用途
(1) 超保真擴增：~280 倍 Taq 的保真性能，是載體構建、點突變、NGS 模板擴增、基因合成的最佳用酶。
(2) 快速擴增：具有 6kb/min 的擴增能力。
(3) 長片段擴增：質粒、λDNA 等簡單模板可以有效擴增>20 kb，基因組可以有效擴增>8 kb，cDNA 可以有效擴增>8kb。
儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 個月）保存。
使用方法
1. 按下表配制反應體系并混合均勻：
2×RAPA HiFi PCR Mix 12.5 μl
上游引物(10 μM) 1 μl
下游引物(10 μM) 1 μl
模板 DNA 1-250 ng
ddH2O up to 25 μl
*模板 DNA 用量參數(shù)(25 μl 反應體系)
5-250 ng Genomic DNA
 0.1-10 ng Plasmid DNA
 1-2 μl cDNA from RT reaction
2. PCR 擴增循環(huán)參數(shù)
（1）擴增片段<5kb 時采用如下程序
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1
st Cycle 95°C 1min
25-35 Cycles
95°C 30s
50~60°C 30s
72°C 6kb/min
Last Cycle 72°C 2min
（2）擴增片段>5kb 時采用如下程序
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1st Cycle 92°C 1min
25-35 Cycles
92°C 10s
50~60°C 30s
72°C 2-3kb/min
Last Cycle 72°C 2min
3. 電泳：1% 瓊脂糖凝膠電泳，上樣 5 μl，電泳結束在紫外燈下檢測條帶。
4. 注意事項：（1）當模板 GC 含量>65%時，請?zhí)砑?× Q-Solution（Cat. No.: A3002）。（2）當擴增片段<1kb 時，延伸時間可直接使用 15s，當擴增片段>5kb 時，按照2-3kb/min 的延伸時間進行設置，能獲得更高的產量。（3）由于不同的 PCR 管其導熱性能有所不同，通常 PCR 采用25μl 體系可以獲得更高的產量。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

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