大腸桿菌通用PCR試劑盒(含致病性和非致病性)說明書
樣本處理及要求: 1.血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
試劑盒組成及試劑配制: 1. 酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔)。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard):2瓶(凍干品)。 3. 樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶 4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。 5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。 6. 生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100) 7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100) 8. 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
反應(yīng)五要素: 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則: ①引物長(zhǎng)度: 15-30bp,常用為20bp左右。 ②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 ⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 操作流程: 1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。 2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL; 3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL;空白孔不加。 4.除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。 6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。 7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。 樣本:血清 血漿 組織勻漿等液體樣本 標(biāo)記物:血清 血漿 組織勻漿等 應(yīng)用:僅用科研實(shí)驗(yàn)檢測(cè)定量,定性檢 檢測(cè)方法:夾心法 技術(shù)要求:全程按說明書步驟檢測(cè),操作規(guī)范,專業(yè),儀器設(shè)備齊全。 規(guī)格:48t/96t 性狀:液體 運(yùn)輸方式:快遞發(fā)貨 有效期:6個(gè)月品 特點(diǎn):靈敏性高,---性,吸附均勻,吸附性好,回收利用率高,是一款可以讓您放心選購的產(chǎn)品。 使用范圍:此產(chǎn)品供科研實(shí)驗(yàn)使用,不得用于---。 用途:用于測(cè)定人血清、血漿、組織及相關(guān)液體樣本中的含量或活性。 注:本公司提供試劑盒免費(fèi)代測(cè)服務(wù)。需要其他檢測(cè)試劑盒請(qǐng)咨詢銷售人員。
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