公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

該制品為單一組分的 MasterMix（2 倍濃度），包含了反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時(shí)只需要加入引物、模板即可進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無(wú)論DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進(jìn)行高效的恒溫?cái)U(kuò)增。該制品是進(jìn)行 LAMP 及 RT-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。優(yōu)化的反應(yīng)體系，確?？焖俚耐瓿蓹z測(cè)試劑的反應(yīng)體系建立。該系列產(chǎn)品不包含任何其它輔助染料，在 LAMP 的擴(kuò)增搭配 OG 橙綠變色管進(jìn)行可視化變色反應(yīng)。除此外，該制品還可以用于其它恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)，包括 CPA、SMAP 等。
儲(chǔ)存：長(zhǎng)期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用實(shí)例（以 LAMP OG 橙綠變色為例）橙綠變色染料（OG Dye）以凍干的形式預(yù)加在 8 聯(lián)管蓋上。在 LAMP 反應(yīng)完畢后（在反應(yīng)完畢前，務(wù)
必不能將管蓋上染料混入反應(yīng)液中），將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反應(yīng)產(chǎn)物將與 OG 染料形成強(qiáng)烈的綠色肉眼可見(jiàn)變色反應(yīng)（陽(yáng)性），而未發(fā)生擴(kuò)增的 EP管為深橙色（陰性）。
（1）配制反應(yīng)體系
在 0.2ml EP 反應(yīng)管中加入下述試劑
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4 μM、F3/B3 分別為 2 μM全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙綠變色管（蓋上管蓋后務(wù)必不能再劇烈混合與倒置，以防止將管蓋上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反應(yīng)液中將會(huì)終止 LAMP 反應(yīng)）。
實(shí)驗(yàn) LAMP Primer Mix 分別采用 1、1.5、2 μl，以陰性不變色，陽(yáng)性樣品正常變色為標(biāo)準(zhǔn)，作為后續(xù)測(cè)試用量。
（2）反應(yīng)體系配好后，置于 60~68°C（實(shí)驗(yàn)采用65°C）進(jìn)行反應(yīng) 20~45min。（擴(kuò)增良好的引物組合，通常 25min 即可變色，一般不超過(guò) 45min，實(shí)驗(yàn)設(shè)置20、25、30、45min）。
（3）觀察結(jié)果：觀察結(jié)果時(shí)，盡可能不要與配制反應(yīng)空間共用，以防止污染操作臺(tái)。將反應(yīng) EP 管倒置，并手腕輕甩，反應(yīng)液浸泡 EP 管蓋上的 OG 染料，靜置 30s。再將 EP 反應(yīng)管正置，并輕甩反應(yīng)液到 EP 管底部，此時(shí)擴(kuò)增樣品將變?yōu)轷r艷肉眼可見(jiàn)綠色，而陰性未發(fā)生擴(kuò)增的管將為深橙色。
注意事項(xiàng)
1. 在用于其它恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)（如 CPA、SMAP 等），可參考如上策略進(jìn)行使用，反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)需要調(diào)整。
2. 關(guān)于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應(yīng)體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)液上部，以減少氣溶膠的污染。
3. 鑒于特殊的生產(chǎn)工藝， 全系恒溫?cái)U(kuò)增 Mix 系
列均不能進(jìn)行濁度分析。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：