商品屬性：

該制品為全體系凍干微球制品，內含恒溫擴增所用的反應緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，其不包含任何染料，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉錄），還具有依賴于DNA 的聚合酶活性，因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及RT-LAMP 擴增反應的試劑。
本制品不包含任何顯色染料，可自行搭配相關染料或檢測手段進行 LAMP 反應，包括搭配 OG 染料管進行橙綠變色、搭配標記 Oligo 進行試紙條檢測、搭配熒光染料進行熒光檢測、搭配 Molecular Beacon 探針進行熒光檢測等方法。
儲存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個月。
使用方法：（進行 LAMP 橙綠變色擴增）：
1. 關于 OG 橙綠變色管說明：橙綠變色染料（OG Dye）以烘干的形式預加在8聯(lián)管蓋上。LAMP反應完畢后，將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP的反應產物將與 OG 染料形成綠色肉眼可見變色反應（陽性），而未擴增的 EP 管為深橙色（陰性）。本試劑管常溫長期保存。
2. 配制變色 LAMP 反應體系
在 OG 染料管（0.2ml EP）反應管中加入下述試劑
Bst4.0 Basic Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、
注意：全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙
3. 反應體系配好后，置于 65°C 進行反應 15~30min。（擴增良好的引物組合，通常 20min 即可變色，一般不超過30min）。
4. 觀察結果：反應結束后，從加熱裝置中將反應管取出，室溫 2min，使整個反應管冷卻下來。再次用力將反應管
注意：
（1）觀察結果時，盡可能不要與配制反應空間共用，以防止污染操作臺。
（2）盡管  選取的為高密封
注意事項：
（1）關于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應液上部，以減少氣溶膠的污
（2）在使用其它熒光染料時，使用濃度可自行優(yōu)化，通染料可能導致擴增失敗。
（3）本試劑不支持，濁度、pH 變色、HNB 變色反應，請勿嘗試。
（4）關于 LAMP 成品試劑的建議， Bst 4.0 Basic Bead凍干球和 OG 橙綠變色管均為室溫穩(wěn)定狀態(tài)，可長期保存。將擴增引物加入到 OG 橙綠變色管底部，于 70°C 烘干，再加入一粒凍干球即可制備成全體系檢測試劑。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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