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該 DP-Probe(DisPlaceable Probe)為鏈置換熒光探針，專用于LAMP 的熒光擴增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 試劑時表現出極為出色的特異性，可以大幅降低非特異性擴增。LoopDP-Probe Pair 是將 Loop 引物進行改造（LF/B 任意一條均可），其由兩條標記引物退火組成：熒光猝滅引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和熒光報告引物（Tail 互補區(qū)+3’發(fā)光基團），其不發(fā)熒光。在 LAMP反應中 Loop 引物滲入到“啞鈴"結構，由擴增返回“啞鈴"延伸并置換游離的熒光報告引物，累積產生熒光信號。有經驗的研究人員可根據參考文獻自行制備 LAMP Loop DP-Probe Pair，經驗不足的人員可委托  來制備， 提供三種熒光標記的探針。需要客戶提供 Loop 序列，并指明需要的熒光標記（FAM/JOE/ROX）。

eLAMP DP-Probe 試劑的開發(fā)簡述
1. 引物的粗篩選
無論是變色、試紙條、熒光法 eLAMP 試劑的開發(fā)，前期的測試過程， 推薦采用價格較低的液體 HotStart Bst4.2 SYBR Green試劑（進行粗篩選。通常篩選的引物為 3-5 組。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.測試樣品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重復)
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到總體積 25 μl置于 70°C 反應 45min，1min 收集一次熒光信號。

良好的引物組具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies <15min;10Copies<20min, NTC 均>40min. 以上實驗需要反復確認，以確
保核心引物的工作效率，否則重新篩選，再進行后續(xù)的其它測試。
2. Loop DP-Probe Pair 的制備
根據上述引物組的篩選情況，選取最佳引物組。在此基礎上改造LF 或 LB，改造哪一條效果更佳，必須經過測試。下面以改造 LF為例進行說明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制備）。

注意：

（1）測試試劑更改為 HotStart Bst4.2 Basic 試劑。

（2）10xeLAMP Mix 引物濃度有調整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
置于 70°C 反應 45min，1min 收集一次熒光信號（注意根據探針熒光標記，選取正確的熒光通道）。與 SYBR Green 結果相比來看，時間會滯后 1-3min。NTC 的控制會明顯提升。

此時可進一步做后續(xù)的其它項目測試。
3. 如有試劑凍干制備的需求可采用如下幾種方案：
（1）(液體試劑)+PrimerMix 自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（2）PrimerMix+(引物凍干劑)自行凍干，加入 (凍干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（4）委托  進行全體系凍干。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。

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